Kurzfassung. Die Erkennung von mikrobiellen Gefahrensignalen durch Makrophagen fu¨hrt zu ausgepra¨gten Vera¨nderungen des Zytoskeletts. Die daraus resultierende morphologische Vera¨nderung (Spreading) fu¨hrt zur Variation der Kontaktfla¨che zwischen Zellen und Oberfla¨chenmaterial. Bisher wird die Vermessung durch manuelle Annotation einer jeden einzelnen Zelle durchgefu¨hrt. Dieser sehr zeitaufwendige Schritt soll durch den Einsatz von semi-automatischen Werkzeugen unterstu¨tzt und beschleunigt werden. Hierfu¨r wird ein multimodales Segmentierungsverfahren erstellt, das mittels erweiterter Wasserscheidentransformation eine Segmentierung der Zellkerne in DAPI Fa¨rbung erstellt. Diese Information u¨ber die Zellkerne wird als Initialisierung fu¨r ein Fast Marching Level Set Verfahren verwendet um mittels Anti-CD11b-APC gefa¨rbte Makrophagen zu segmentieren. Dabei zeigt sich dass durch den multimodalen Ansatz gute Segmentierungsergebnisse auch bei konfluenten Zellbildern mo¨glich sind.
Aufgrund von fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen von Makrophagen ist bekannt, dass eine Stimulation mit LPS (Lipopolysaccharid) zu morphologischen Vera¨nderungen der Zelle fu¨hrt. Stimulierte Zellen weisen eine vergro¨ßerte Kontaktfla¨che auf und wirken optisch flacher. Um diese zu quantifizieren soll die Gro¨ßenvera¨nderung der Kontaktfla¨che von Makrophagen zu vorgegebenen Zeitpunkten (15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h) nach Stimulation mit LPS gemessen werden. Der bisherige Arbeitsablauf erfordert eine manuelle Markierung jeder Zelle (mit Zeiss Axio Vision). Dieser fu¨r eine große Anzahl von Zellen sehr arbeitsintensive Schritt soll mit Hilfe von neuen Softwarewerkzeugen vereinfacht werden.
Da die Segmentierung von Fluoreszenzfa¨rbungen seit einigen Jahren von
großem wissenschaftlichen Interesse ist, existieren eine Vielzahl von
Publikationen zur Segmentierung von DAPI gefa¨rbten Zellkernen. Dabei ist die
Wasserscheidentransformation [
Die Segmentierung der Zellen selbst ist bei vielen Zelltypen
unverha¨ltnisma¨ßig schwieriger als die Segmentierung der Kerne. Srinivasa et al. [
Die Segmentierung der hier untersuchten Makrophagen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da diese partiell stark konfluent auf dem Objekttra¨ger wachsen. Dies fu¨hrt zu U¨berlagerungen die teilweise durch den menschlichen Experten nicht aufgelo¨st werden ko¨nnen. Bei einer manuellen Segmentierung werden diese Zellen ausgelassen. Außerdem ist es in vielen Fa¨llen nicht mo¨glich eine zuverla¨ssige manuelle Segmentierung ohne Hinzunahme der Zellkerne zu erstellen. 2
Zur Validierung und Optimierung der Segmentierungsalgorithmen wurden 21 Aufnahmen von ausdifferenzierten Knochenmark Makrophagen nach LPS Stimulation angefertigt und manuell annotiert (insgesamt 421 Zellen). Fu¨r die Fluoreszenzfa¨rbung der Zellen wurden APC konjugierte Antiko¨rper gegen den Oberfla¨chenrezeptor CD11b sowie der Farbstoff DAPI fu¨r die Zellkernmarkierung verwendet. Dabei wurden Zellen deren Grenzen nicht zweifelsfrei bestimmt werden konnten nicht in die Grundwahrheit aufgenommen. Abb. 1 zeigt eine repra¨sentative Fluoreszenzaufnahme und die dazugeho¨rige Hand Annotation.
Da die Segmentierung der Makrophagen eine große Herausforderung darstellt verwenden wir einen mehrstufigen Segmentierungsprozess bei dem zuna¨chst eine (a) (b) (c)
phagen ohne Hinzunahme der Kerninformationen ist schwer mo¨glich. ZB. wu¨rde die in (a) durch weiße Pfeile gekennzeichnete Zelle wahrscheinlich als zwei Zellen annotiert werden. Unter Einbezug der Informationen u¨ber die DAPI gefa¨rbten Zellkerne (b) ist ersichtlich, dass es sich nur um eine einzelne Zelle handelt. (c) zeigt die manuelle
Segmentierung der Zellkerne erstellt wird. Analog zum Vorgehen eines
menschlichen Betrachters wird im na¨chsten Schritt das Wissen u¨ber die
Kernsegmentierung fu¨r die Segmentierung der Makrophagen genutzt. Hierfu¨r wird die Kontur
der Kerne als Initialisierung fu¨r ein Fast Marching Level Set Verfahren [
Da die Information der Zellkerne in den DAPI Aufnahmen als Initialisierung fu¨r ein Level Set Verfahren zur Segmentierung der Zellgrenzen genutzt werden soll, ist deren genaue Segmentierung essentiell.
Um Variationen in den Bilddaten mo¨glichst robust behandeln zu ko¨nnen wird
ein morphologisches O¨ffnen mit einem flachen Strunkturelement mit Radius r
(2 ≤ r ≤ 20) angewandt. werden kleine helle Artefakte aus dem Bild entfernt.
Um Vorder- und Hintergrund voneinander zu trennen wird ein grauwertbasiertes
k-Means Clustering [
Nach der Vorverarbeitung wird analog zu Xia et al. [
Die segmentierten Zellkerne aus den DAPI Bildern werden als Initialisierung fu¨r
ein Fast Marching Level Set Verfahren genutzt [
Dabei werden die Geschwindigkeitsfunktionen F1; F2 und F3 miteinander verglichen. Bei Verwendung einer konstanten Geschwindigkeitsfunktion F1 = 1 entstehen Voronoi Regionen.
Da sich Zellgrenzen ha¨ufig an Stellen mit starken Gradienten befinden, sollen solche Pixel die Wellenfront bremsen. Zur Berechnung der Gradientensta¨rke wird die Ableitung eines Gaussfilters ∇G mit Standardabweichung (1 ≤ ≤ 20) verwendet. Hieraus resultiert die Geschwindigkeitsfunktion F2 = (1 + |∇G ∗ ILP S|)−1:
Um markante Kanten sta¨rker zu gewichten kann die Gradientensta¨rke exponentiell gewichtet werden: F3 = (1 + e|∇G ∗ILPS|)−1.
Standardabweichung (Pco) Um die A¨ hnlichkeit eines Segmentierungsergebnisses S mit der manuell erstellten Grundwahrheit T zu quantifizieren wird eine Kombination aus U¨ bersegmentierung, Untersegmentierung und U¨ berlappungsgrad verwendet. Die A¨hnlichkeit von S und T wird im folgenden als P bezeichnet.
P = 31 ( ||SS ∩∪ TT || + (1 − |T \(S|T ∩| T )| ) + (1 − |S\(S|S∩| T )| )) (1) Da in vielen biologischen Anwendungen die Anzahl von Zellen von Bedeutung ist, wird zusa¨tzlich ein Mapping durchgefu¨hrt um irrtu¨mlich gefundene oder nicht gefundene Zellen in die Metrik mit aufzunehmen. Dabei bezeichnet NT P die Anzahl der korrekt gefundenen Zellen, NF P die Anzahl der irrtu¨mlich segmentierten Zellen und NF N die Zahl der nicht gefundenen Zellen. Die korrigierte Metrik Pco ist dann folgendermaßen definiert
Pco =
NT P + NF1P + NF N ∑i=m1 Pibest wobei Pibest das Ergebnis bezeichnet das aus dem Vergleich mit der am besten passenden, in der Grundwahrheit enthaltenen, Zelle resultiert. 3
Folgende Ergebnisse veranschaulichen die Segmentierungsleistung unter Verwendung der in Abschnitt 2.4 beschrieben Metrik nach erfolgter Parameteroptimierung Bei der Nutzung der verschiedenen Geschwindigkeitsfunktionen sind (Tab. 1) keine deutlichen Performance-Unterschiede sichtbar. Bei Betrachtung der Ergebnisbilder (Abb. 2) fa¨llt jedoch auf, dass F2 ha¨ufiger u¨ber Zellgrenzen hinweg la¨uft als F3. Dies wird jedoch durch das sta¨rkere Auslaufen von F3 kompensiert. (2)
(a) F1 (b) F2 (c) F3 4
Die Experimente zeigen dass unter Hinzunahme des Kernwissens eine Scha¨tzung der Zellgrenzen auch unter schwierigen Bedingungen mo¨glich ist. Diese Scha¨tzung kann nach interaktiver Korrektur bereits fu¨r die Messung der Zellgro¨ße verwendet werden. Bei Verwendung von F3 ist bereits ein Großteil der Zellgrenzen korrekt segmentiert. Folglich mu¨ssen relativ wenige Zellgrenzen manuell nachgebessert werden. Dies fu¨hrt, verglichen mit einer manuellen Segmentierung, zu einer erheblichen Zeitersparnis. Zuku¨nftige Experimente umfassen die Entwicklung von neuen Geschwindigkeitsfunktionen die weniger ha¨ufig auslaufen und Zellgrenzen zuverla¨ssiger detektieren.