Kurzfassung. Durch eine Laser gestu¨tzte Mikroskopiemethode lassen sich Nanopartikel in vitro auch mit Lichtmikroskopen als mobile Objekte visualisieren. Aus Form- und Mobilita¨tseigenschaften visualisierter Nanopartikel werden mit Bildverarbeitungsmethoden charakteristische Parameter gewonnen, mit deren Hilfe unterschiedliche Nanopartikel-Proben in vitro analysiert und differenziert werden ko¨nnen, um in Folgeexperimenten Aussagen u¨ber deren gesundheitsscha¨digende Wirkungen erzielen zu ko¨nnen.
Werden NP von einem Laserstrahl getroffen, so streuen sie die Strahlung und
werden im Mikroskop sichtbar, da ihr scheinbarer Durchmesser um ein Vielfaches
gro¨ßer ist als ihr wirklicher Durchmesser. NP erscheinen als sich
unterschiedlich schnell bewegende, unterschiedliche helle und unterschiedlich ausgedehnte
Punkte, wobei ihre Bewegung vor allem durch die Brownsche
Molekularbewegung bestimmt wird [
Die gemessenen Gro¨ßen statischer und dynamischer Parameter werden hier am Beispiel von monodispersen Polystyren Partikel (Durchmesser 100 nm) exemplarisch gezeigt. Abbildung 1, links zeigt sechs NP mit unterschiedlicher Form und Helligkeit.
Das sehr hell dargestellte Partikel (d) weist eine runde Struktur auf, wa¨hrend ein etwa gleichhelles Partikel (c) eine elliptische Form besitzt. Die Partikel (b), (e) und (f) sind deutlich dunkler als NP (c) bzw. (d), weisen aber ebenfalls unterschiedliche Rundheiten auf. Da sich Partikel unterschiedlich weit entfernt von der z-Referenzebene befinden ko¨nnen, werden solche eher randsta¨ndigen Partikel weniger hell strahlen als solche, die sich im Zentrum des Laserstrahls befinden. Das Partikel (a) zeigt zudem eine Doppelstruktur, die sich als Kollision zweier NP deuten la¨sst. Solche Kollisionen sind u¨berwiegend scheinbare (so genannte visuelle) Kollisionen, weil es hier lediglich zu einer U¨ bereinstimmung in den ebenen Koordinaten kommt. In der Tiefe z ko¨nnen sie sehr weit auseinander liegen. Echte Kollisionen, die zu einer Agglomeration der Partikel fu¨hren, sind eher selten, wenn die Partikelkonzentration in der Flu¨ssigkeit niedrig ist (typisch: 107 108 Partikel/ml). Gleichwohl sind sie identifizierbar, denn der Diffusionskoeffizient der beteiligten Partikel ist vor der Kollision i.A. deutlich ho¨her als der des durch Kollision entstandenen Agglomerates.
Abbildung 1, Mitte zeigt eine Verteilung der diffundierenden NP als das Ergebnis einer Monto-Carlo-Simulation in drei Dimensionen. In der 3D-Graphik haben alle simulierten Partikel die gleiche Helligkeit, aber unterschiedliche Radien, entsprechend der jeweiligen Diffusionskoeffizienten (aus Beobachtungen empirisch zugeordnet). Die Abbildung 1 zeigt rechts eine NP-Simulation, die sich auf die 2D-Auswertemethode des N anoSightTM-Prinzip beschra¨nkt, wobei sich der z-Abstand der NP durch unterschiedliche Helligkeiten ausdru¨ckt. Fu¨r beide Simulationen wurden ebenfalls die zugeho¨rigen Dichtefunktionen fu¨r die Diffusionskoeffizienten und die NP-Durchmesser ermittelt. Typische Ergebnisse der Abb. 1. Momentaufnahme diffundierender Nanopartikel (links: Originalregistrierung; Mitte: a¨quivalente 3D-Simulation; rechts: korrespondierende 2D-Visualisierung). Abb. 2. Dichtefunktionen der gemessenen und simulierten NP-Diffusionskoeffizienten [10( 10)cm2=s] (links) NP-Durchmesser [nm] (rechts).
Tabelle 1. Mittelwert und Standardabweichung von NP-Parametern (Durchmesser, simulierter Durchmesser, Diffusionskoeffizient, Kompaktheit, Symmetriefaktor, fraktale Dimension).
Tabelle 2. Mittelwert und Standardabweichung von NP-Parametern fu¨r eine QuarzProbe.
diameter [nm] Diffusionsanalyse (Abb. 2) zeigen, dass Messung und Simulation kaum Unterschiede aufweisen.
Ein t-Test ergibt, dass es zwischen den Durchmesser-Mittelwerten der Simulation und der Messung keinen signifikanten Unterschied gibt, was die Tabelle 1 belegt. In dieser Tabelle sind die fu¨r die Polystyrene-Probe erhobenen Bild charakterisierenden Parameter erfasst. Dazu geho¨rt der mittlere Partikeldurchmesser, der hier mit ca. 126 nm den von der Industrie genannten Wert von 100 nm signifikant u¨berschreitet. Sowohl die 3D- als auch die NanoSight-analoge 2DSimulation ergaben vergleichbar große Durchmesser. Typisch fu¨r die NP-Probe sind Kompaktheitswerte um 0.8 herum, woraus zu schließen ist, dass zahlreiche Partikel im Mikroskopiebild keine perfekte Kreisform aufweisen.
Zudem finden wir ha¨ufig Asymmetrien bezu¨glich der Grauwertverteilung innerhalb des dargestellten NP (ideale Grauwert-Symmetrie wu¨rde zu einem Faktor s = 1 fu¨hren, gemessen wurden hingegen Werte um s = 0:7). Die fraktale Dimension der durch die Partikeldiffusion erzeugten Pfade lag mit ca. 1.6 deutlich u¨ber dem Wert einer u¨berwiegend geraden Ausbreitungsrichtung (f = 1), aber weit unterhalb einer kompakten fla¨chenartigen Ausbreitung (f=2). Tabelle 2 entha¨lt die Parameterwerte fu¨r eine andere NP-Probe (Quarz). Daraus ergibt sich, dass es zwischen verschiedenen NP-Sorten offenbar charakteristische Unterschiede hinsichtlich der genannten Parameter gibt. 4
Mit Hilfe typischer Bildverarbeitungsmethoden konnten aus Bildsequenzen Parameter identifiziert werden, mit deren Hilfe eine Charakterisierung von solchen NP gelang, deren gesundheitsscha¨dliche Wirkung in Folgeexperimenten untersucht werden soll. Die Gestalt der NP konnte durch Formparameter wie Kompaktheit c und Symmetriefaktor s erfasst werden, wa¨hrend sich die dynamischen Eigenschaften der NP durch den Diffusionskoeffizienten (gewonnen aus gemessenen bzw. simulierten Diffusionen) bzw. der fraktalen Dimension des jeweiligen Bewegungspfades kennzeichnen ließen. Letztlich konnten NP-Durchmesser aus korrespondierenden Diffusionskoeffizienten, die sowohl durch Messung als auch durch Monte-Carlo-Simulationen gewonnen wurden, ermittelt werden.
In den angegebenen Beispielen nehmen die Parameter typische Werte an, mit denen die Proben durch ihre Bildeigenschaften charakterisiert und von anderen Proben unterschieden werden ko¨nnen. Zudem zeigt der Vergleich des mittleren Durchmessers (Messung und Simulation) mit den Herstellerangaben, ob die in der Probe vorhanden NP diese Gro¨ße auch wirklich besitzen. Vergleiche von Durchmesser-Dichtefunktionen gemessener und simulierter NP erlauben zusa¨tzlich Ru¨ckschlu¨sse auf die Homogenita¨t von Proben.
Danksagung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des Bundesministeriums fu¨r Bildung und Forschung gefo¨rdert (NanoGEM; Fo¨rdernummer 03X0105G).